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通用PCR试剂盒

通用PCR试剂盒

简要描述:通用PCR试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。通用PCR试剂盒它采用M-MLV进行反转录反应,能够获得较长的反转录产物。同时,在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中,还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。

产品型号:

所属分类:PCR试剂盒

更新时间:2020-12-17

详细说明:

 通用PCR试剂盒

本试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应,能够获得较长的反转录产物。同时,在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中,还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。本试剂盒中配制的酶均为进口的酶。RT酶采用进口的M-MLV,所以cDNA更长,基因的信息保留得更完整!反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。本试剂盒使用方便、快捷,可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)产品简介

莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV RT)是一种RNA依赖的DNA聚合酶,能使mRNA(>5kb)转录为cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相对于禽成髓细胞瘤病毒反转录酶较弱,更适合用来反转录较长的mRNA。M-MLV RT应用于以RNA为模板合成cDNA的一条链。

注意:M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反转录酶,因此要得到和用AMV 反转录酶一样产量的cDNA需加入更多单位的M-MLV反转录酶。

通用RT-PCR试剂盒使用方法

1)使用方法简介以用2mg总RNA为例。在无RNase离心管中,加入0.5mg引物至含总RNA的样品中,总体积不大于15ml。70℃,5分钟打开模板链形成的二级结构。立即放于冰上降温防止二级结构恢复,随后短暂离心使液体集中在离心管底。

2)加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。

注意:不要改变引物的加入比率。

通用PCR试剂盒常见问题与解决方法:

常见问题

可能原因

解决方法

 

 

阳性对照、待测样本均无条带。

PCR反应体系或反应条件不合适。

使用梯度PCR摸索PCR反应条件。

PCR试剂保存不当失去活性。

2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。

引物设计问题。

尝试重新设计引物进行检查。

 

 

 

 

 

 

阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。

不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。

使用新鲜的试剂。

加入组织裂解液过量。

增大反应体系,或减少裂解液的用量。

样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。

裂解混合液液可在4℃保存2-3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。

模板加入量不适合。

在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时,可以降模板浓度调节到低于10%的范围。

PCR循环数不足。

适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。

 

 

 

非特异性扩增

PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。

增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。

PCR引物错配。

重新设计PCR引物。

配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。

PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。

 

 

 

阴性对照出现目的条带

操作工具或试剂污染。

实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

样本间交叉污染。

每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。

 

 



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