探针法荧光定量PCR试剂盒常见问题处理方法

　　以下是探针法荧光定量PCR试剂盒常见问题的处理方法：

　　1.无扩增产物

　　可能原因：样本中无目标DNA、引物设计不当、Taq酶失活等。

　　解决方案：检查样本质量，确保样本中含有足够的目标核酸；优化引物设计，使其更特异性地结合目标序列；更换新的Taq酶。

　　2.非特异性扩增

　　可能原因：退火温度过低、模板DNA污染等。

　　解决方案：适当提高退火温度，以增强引物与目标序列的特异性结合；优化模板纯化步骤，去除杂质和其他非特异性DNA片段。

　　3.探针法荧光定量PCR试剂盒荧光信号异常

　　可能原因：探针或引物浓度不当、荧光染料干扰等。

　　解决方案：仔细调整探针和引物的浓度，使其达到最佳工作范围；避免使用可能干扰荧光信号的染料或其他物质。

　　4.没有Ct值

　　可能原因：循环数不够、PCR程序设置错误、引物或探针降解、模板量降解或上样量不足、引物探针不合适等。

　　解决方案：增加循环次数，但一般不超过45循环；检查并修正PCR程序中检测荧光信号的步骤；通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解，如有需要则更换；对未知浓度的样本从系列稀释样本的最高浓度做起，避免模板降解，将模板样本小量分装储备，防止反复冻融；重新设计更合适的引物和探针，特别是要确保引物跨越内含子以扩增基因组DNA，且上下游引物Tm值相差不宜超过4℃。

　　5.Ct值过晚

　　可能原因：扩增效率低、PCR程序不合适、MgCl?浓度不合适、PCR产物太长、模板中存在抑制物等。

　　解决方案：优化引物之间或者引物和探针的比例；重新设计引物或探针；改用三步法进行反应，或者优化退火/延伸温度，可适当降低退火温度，并在推荐的时间条件下延长10s；增加镁离子浓度；缩短PCR产物长度；使用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

　　6.阴性对照扩增有信号

　　可能原因：引物设计不够优化、引物浓度不佳、镁离子浓度过高、模板有基因组污染、交叉污染等。

　　解决方案：优化引物设计，避免引物二聚体和发夹结构的出现；适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比；适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒；在RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增；对操作环境进行处理，更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等，防止交叉污染。

　　7.探针法荧光定量PCR试剂盒标准曲线不佳

　　可能原因：标准品稀释或者加样误差、标准品降解、引物或探针不佳、模板中存在抑制物等。

　　解决方案：仔细进行标准品稀释和加样操作，确保标准品呈梯度；避免标准品反复冻融，将高浓度DNA模板分装保存于-20℃或-80℃，现配现用；重新设计更好更稳定的引物或探针；控制模板浓度在一定范围内，一般为50—500ng。

　　8.熔解曲线峰不特异

　　可能原因：引物设计不够优化、引物浓度不佳、模板有基因组污染、离子浓度不合适等。

　　解决方案：优化引物设计，避免引物二聚体和发夹结构的出现；适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度比例；在RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异性扩增；适当降低镁离子浓度，或选择更适合的mix试剂盒。

　　9.扩增曲线异常

　　可能原因：模板的浓度太高或者降解、荧光染料的降解、操作不当导致指纹或字迹污染、液体挥发、气泡等。

　　解决方案：调整模板浓度至合适范围，避免反复冻融导致降解；更换新鲜的荧光染料；在操作荧光定量PCR时戴上新的一次性手套，盖上盖子避免任何指纹或者字迹等污染；检查耗材气密性，防止液体蒸发；规范移液枪加样操作，避免产生气泡。