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PCR试剂盒通用原则和操作流程具体是怎样的

更新时间:2022-05-25 点击量:799
   PCR试剂盒通用原则:
  1, 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
  2, 扩增子的长度应不超过400bp,理想的*能在100-150bp内,扩增片断约短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
  3, 保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号。
  4, 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
  5, 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
  PCR试剂盒操作流程:
  1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器 、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。
  2. 为避免RNA降解,样本处理过程应在0-4℃条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
  3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
  4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。
  5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在一次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。
  6. 为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
  7. 仪器 扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置;不同批号试剂不能混用。
  8. ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正,淬灭基因选择None。
  9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。