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基于细胞的酶联免疫检测实验

更新时间:2017-04-11 点击量:525

基于细胞的酶联免疫检测实验


基于细胞的酶联免疫检测实验(Cell Based Elisa)可以:

(1)检测高通量的样本,定量细胞膜上或细胞内的蛋白质的表达情况。
(2)用于磷酸化蛋白质的检测,易降解蛋白质的检测,少量细胞目的蛋白质的检测。
 
试验方法原理
 
先将细胞种于 96 孔板中,对细胞进行不同条件的处理。待检测目的蛋白时,对细胞进行多聚甲醛的固定、灭活、打孔及封闭非特异性结合位点。根据抗原抗体反应的原理,一抗孵育与目的蛋白质结合,加入酶标记二抗与一抗结合,加入底物显色后酶标仪读取数值。
 
实验材料

细胞
试剂、试剂盒:  多聚甲醛 Cell Based Elisa 试剂盒
仪器耗材: 移液枪 酶标仪 恒温箱
 
实验步骤
 
1 将细胞种于 96 孔培养板中。
2 培养细胞,根据实验设计对细胞进行不同条件的处理。
3 待检测目的蛋白时,对细胞进行多聚甲醛的固定、灭活、打孔及封闭非特异性结合位点。加入一抗孵育与目的蛋白质结合,加入酶标记二抗与一抗结合,加入底物显色后酶标仪读取数值。
4 细胞清洗后加入结晶紫与细胞核结合读取数值,作为内参值进行比对。
5 数据处理。
 
注意事项
 
1 根据细胞的大小和生长情况进行种板和培养,待检测时细胞的密度控制在 75-90%。
2 对于悬浮细胞,加入 100ul 10ug/ml 的多聚-L-赖氨酸,37℃ 的条件下处理 30 min 将悬浮细胞贴壁到培养板上,PBS 清洗两次,每次 5 min。
3 若是悬浮细胞,加入 100ul 的 8% 多聚甲醛室温孵育 25-30 min 将细胞固定。
4 甲醛具有挥发性,终止液具有腐蚀性,请带好防护设备。
 
优势
 
1 样本的制备过程中,不涉及裂解细胞,只需将细胞及蛋白质原位固定,降低蛋白质发生降解的可能性。
2 在操作过程中,不涉及传统免疫印迹法的制胶,跑胶,转膜,曝光等步骤,为研究人员节省很多时间。
3 整个操作在 96 孔板中进行,容易实现高通量样本的检测,或者少量细胞目的蛋白质检测。
4 操作简单,很容易实现多个平行,多次重复,所得数据具有统计分析意义。 
 
应用 Cell Based Elisa 发表的文章:
 
1 Alexia Arpel, Paul Sawma, Caroline Spenle, Justine Fritz, Lionel Meyer, Norbert Garnier, et al. Transmembrane Domain Targeting Peptide Antagonizing ErbB2/Neu Inhibits Breast Tumor Growth and Metastasis. Cell Reports 2014; 8, 1714–1721.
 
2 Shixin Xu, Aiqin Zhong, Xiaokun Bu, HuiningMa,Wei Li, Xiaomin Xu, Junping Zhang. Salvianolic acid B inhibits plaets-mediated inflammatory response in vascular endothelial cells. Thrombosis Research 2015; 135, 137–145.
 
3 Henri H. VERSTEEG, Evert NIJHUIS., Gijs R. VAN DEN BRINK, Maaike EVERTZEN, Gwenda N. PYNAERT,Sander J. H. VAN DEVENTER, et al. A new phosphospecific cell-based ELISA for p42/p44 mitogen-activated protein kinase (MAPK), p38 MAPK, protein kinase B and cAMP-response-element-binding protein. Biochem. J 2000; 350, 717±722.
 
4  Rubina W. Saeed,Santosh Varma,Tina Peng-Nemeroff,Barbara Sherry,David Balakhaneh, Jared Huston, et al. Cholinergic stimulation blocks endothelial cell activation and leukocyte recruitment during inflammation. JEM 2005, Vol. 201, 1113–1123.
 
5 Sanjiv Dhingra, Ashim K. Bagchi, Ana L. Ludke, Anita K. Sharma, Pawan K. Singal. Akt Regulates IL-10 Mediated Suppression of TNFa- Induced Cardiomyocyte Apoptosis by Upregulating Stat3 Phosphorylation. PLoS ONE 2011; 6(9): e25009.
 
6 H Yokoyama, Y Ikehara1, Y Kodera, S Ikehara, Y Yatabe, Y Mochizuki et al. Molecular basis for sensitivity and acquired resistance to gefitinib in HER2-overexpressing human gastric cancer cell lines derived from liver metastasis. British Journal of Cancer 2006; 95, 1504 – 1513.
 
7 MICHAEL WEICHHAUS, JOHN BROOM, KLAUS WAHLE and GIOVANNA BERMANO. A novel role for insulin resistance in the connection between obesity and postmenopausal breast cancer. 
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 2012; 41: 745-752.
 
8 S. Fineschi, F. Cozzi, D. Burger1, J.-M. Dayer, P. L. Meroni and C. Chizzolini. Anti-fibroblast antibodies detected by cell-based ELISA in systemic sclerosis enhance the collagenolytic activity and matrix metalloproteinase-1 production in dermal fibroblasts. Rheumatology 2007; 46:1779–1785.
 
9 Abderrahim El Guerrab1, Rabah Zegrour, Carine-Christiane Nemlin, Flavie Vigier, Anne Cayre, Frederique Penault-Llorca3, et al. Differential Impact of EGFR-Targeted Therapies on Hypoxia Responses: Implications for Treatment Sensitivity in Triple-Negative Metastatic Breast Cancer. PLoS ONE 2011; 6(9): e25080.
 
10 Gopalan Soman, Xiaoyi Yang, Hengguang Jiang, Steve Giardina, and Gautam Mitra. Comparison of GD2 Binding Capture ELISA Assays for Anti-GD2-Antibodies Using GD2-Coated Plates and a GD2-Expressing Cell-Based ELISA. J Immunol Methods. 2011; 373(1-2): 181–191.