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细胞计数与存活测试实验介绍

更新时间:2016-11-03 点击量:647

细胞计数与存活测试实验介绍

实验材料

    0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)  

    Erythosin bluish stain 
     
    取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca /Mg free saline 

    血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) 

    计数器(counter) 

    低倍倒立显微镜 

     粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)

实验步骤

1 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 

2 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100 倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。 

3 计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypan blue等体积混合),zui后乘104 ,即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 
               
4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 

4 若不用血球计数盘,可用Coulter counter 作自动计数,惟无法辨别死细胞或活细胞。 

5 范例:T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液,取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。 

    活细胞数/方格:55 ,62, 49, 59 
    死细胞数/方格:5, 3, 4, 6 
    细胞总数= 243 
    平均细胞数/方格= 60.75 
    稀释倍数= 2 
    细胞数/ml:60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 
    细胞数/flask: 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 
    存活率:225/243﹦92.6 %