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实战分享|小鼠淋巴细胞的提取和分选之经验小结

更新时间:2023-08-21 点击量:542

脾脏是机体重要的免疫器官之一,含有大量的淋巴细胞,占全身淋巴组织总量的25%,在小鼠中,由于小鼠血液量少,从外周血液中分离大量淋巴细胞较为困难,故经常需要从其脾脏中获取大量的淋巴细胞。

不久前,来自华中科技大学同济医学院附属同济医院的李老师在Biomaterials杂志上发布的文章中就用到了上述实验。以下为是李老师分享的一些相关经验。

 

操作步骤

1 材料准备

选取具有正常免疫功能的成年小鼠(所需的小鼠数量根据实验需要决定,通常一只小鼠脾脏可提取的淋巴细胞数量为2~6×107),快速断颈处死(避免脾梗死)后,浸泡于75%酒精中;准备好已消毒的眼科剪、眼科镊,以及一个装有一定量PBS的无菌皿,分离脾脏后置于皿中,全程无菌操作;

2 小鼠脾脏处理

脾脏细胞数量较少时,可用两个1mL无菌注射器的针尖将脾脏戳出大量的空洞后,轻轻刮取脾脏表面,将脾脏细胞刮出;数量较多时,可用细胞滤网进行研磨后离心,也可得到淋巴细胞。

3 离心

15mL离心管中吸入5mL ficoll分离液,倾斜管身,小心吸取含淋巴细胞的PBS缓慢加入ficoll分离液,可见明显液体分层。600rpm梯度离心25分钟,升速/降速均为2;

4 二次离心

得到分为3层的液体, 小心吸取中间层液体(含淋巴细胞+红细胞)并置于新的15mL离心管,补满PBS,600rpm离心5分钟;

5 三次离心

弃上清PBS, 可见黑红色沉淀,加入1~2mL红细胞裂解液,冰上裂解5分钟,补满PBS, 600rpm离心5分钟;

6 获取淋巴细胞

弃上清PBS, 可见白色沉淀,此为总淋巴细胞;计数;

7 重悬淋巴细胞

将提前过夜包被CD3抗体(包被浓度为5ug/mL)的96孔板中的PBS吸弃,配制淋巴细胞培养基,1640全培+巯基乙醇+CD28抗体(终浓度2.5ug/mL),重悬淋巴细胞并加入96孔板,100~200ul/孔,通常淋巴细胞数量为1~3×105个/孔。通常8个小时即可看到T细胞增殖团,刺激48h后可以较好活化T淋巴细胞;

8 分选

若实验目的为分选CD4/CD8 T淋巴细胞,可以省去红细胞裂解操作,直接用磁珠抗体对淋巴细胞进行避光孵育,并用PBS洗掉多余的试剂后,弃上清,用一定量PBS重悬淋巴细胞,缓慢加入预先润湿过的macs tube(已安装到磁力架上)。根据具体试剂和目的可以分为阴选和阳选:阴选需要从分选柱中流下的液体,其中含有目的细胞;阳选则应该等待分选柱中的液体流尽后,将分选柱从磁力架上取下后,并重新加入PBS将分选柱中的阳选细胞冲下,其中含有目的细胞。计数,此后步骤同总淋巴细胞。

 

注意事项

1   由于整个过程需要淋巴细胞长时间处于体外PBS中,所以对PBS的要求比较严格;为保护淋巴细胞,也可以使用专门的淋巴细胞缓冲液,或自行配制含0.4%BSA的PBS缓冲液;

2   有些研究为了更好地促进淋巴细胞的杀伤功能,还会在T细胞培养基中添加IL-2; 但是,很多人认为这样也会加速T细胞进入T细胞耗竭的进程,同时会缩短T细胞寿命;

3   若后续需要进行流式分析,无法再染CD3 和 CD28分子;

4   若用到了OT-I CD8 T细胞,则无需CD3抗体刺激,而是用OVA抗原刺激活化第一信号;

5   以上所有操作均以无菌试剂、耗材,无菌环境内操作为前提。

 
以上为淋巴细胞提取、分选的经验分享,希望对大家有所帮助。同时也欢迎更多老师参与文献奖励活动,分享您的科研干货和心得体会!